【卵巣凍結】ガラス化法と緩慢凍結法の比較

これまでヒト凍結融解卵巣組織移植にて95名の赤ちゃんが誕生していますが、

93名が緩慢凍結法(S法)、2名がガラス化法(V法)の割合で圧倒的に緩慢凍結法での出産が多いことがわかります。

ガラス化法は緩慢凍結法に比較して凍結保護剤の濃度が約4倍高く、融解時間が1/4と短いからではないか。

また、ガラス化法と緩慢凍結法で移植直前の卵巣組織切片内の凍結保護材がWash outされているかを検討するため、

融解段階の卵巣組織内の凍結保護材残量を測定した当院の研究について紹介いたします。

 

方法

この比較研は院内倫理委員会の承認を得て、2016年8月から6か月間に実施しました。

ウシ(multipara and average month is 24.2 M)5頭の卵巣5個、ヒトにおいては研究同意を得られた 5名(40歳以下の女性)の卵巣5個を
①凍結保存中(融解前)
②融解途中
③融解後移植直前
の3か所で凍結保護材の残存量を比較しました。

凍結保護剤濃度と融解時間の比較

凍結保存時の凍結保護剤濃度 融解ステップ時間・温度*
Cryotissue 2.8M/L DMSO+3.7M/L EG 14分間(3ステップ)・室温
Cryosupport 5.64M/L EG 14分間(3ステップ)・室温
Slow freezing 1.5M/L DMSO 65分間 (5ステップ)・室温

* 37℃で1分間融解後の融解ステップ

結果

ウシ卵巣組織における凍結保護剤の残量

Slow Cryotissue Cryosupport
DMSO融解前/td> 52.2±7.6 84.8±12.0 不含 p<0.01
DMSO融解中 1.2±0.5 34.6±4.7 不含 p<0.01
DMSO融解後 0.6±0.9 10.3±2.7 不含 p<0.01
EG融解前 不含 83.2±11.2 124.0±18.2 p<0.01
EG融解中 不含 34.2±6.3 82.2±14.7 p<0.01
EG融解後 不含 10.7±2.7 33.4±9.7 p<0.01

単位はmg/g

融解後の凍結保護剤の残留量(ヒト卵巣組織)

Sample DMSO (mg/g) EG (mg/g)
Vitrification(n=4) Cryotissue
I.before warming 130.0±8.2 112.5±15.0
II. after TS 73.0±8.0 63.5±15.0
III.after DS 37.0±5.4 33.3±5.6
IV.after WS2 9.8±3.3 9.8±3.3
Slow freezing (n=1)
I.before warming 70 <0.05
II. after TS3 0.25 <0.05
III.after WS2 0.39 <0.05

結論

今回の比較検討の結果、ガラス化法では凍結保護剤の残存量が多いことがわかりました。
我々は人体への移植直前では卵巣組織内のCPはWash outされるべきであると考えており、
今後、残留CPの毒性についての検討ならびに移植まで考慮した安心安全で有効性の高い
簡便な卵巣凍結法を目指していきたいと考えております。

 

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